根据美国药典（USP）的规定，共有858个C18液相色谱相，注册码为L1（十八烷基硅烷化学键合到直径1.5至10μm的多孔二氧化硅或陶瓷微孔板或整体式棒上）（3）。大量可商购的C18色谱柱构建在各种固体载体上，并可能显示辅助选择，例如封端和水相容性（AQ）。它们也可以与其他反相液相色谱（RPLC）相混合。尽管在过去的几十年中，二氧化硅颗粒的生产已变得更加标准化，但商用C18中的这些细微差别使新手，甚至是经验丰富的色谱工作者，都很难为给定的应用“抢柱而走”。
二氧化硅是硅和氧的非晶态聚合物。这种聚合物的表面含有反应性硅烷醇（Si-OH），为合成化学键合相提供了多种可能性。早在1950年代，有机硅烷就已用于功能化滤纸以分离类固醇（4）。 1973年，洛克（Locke）正确地预测有机硅烷将通过化学键合相转变HPLC色谱柱，并提到硅烷的聚合通常是通过化学反应进行的化学合成途径，以产生有机硅烷的主要层（5）。同时，他希望通过将特定的基团引入有机硅烷键合试剂中来在固定相键合方面取得新进展。然而，近半个世纪之后，有机硅烷仍通过当时描述的相同化学方法接枝到二氧化硅颗粒上。尽管新的合成方法已应用于反相配体，但仍可通过常规方法（6）生产大部分可商购的相。
C18配体化学
利用美国道康宁公司的约翰·斯皮尔（John Speier）开发的反应，沃特世的科学家成功地合成了十八烷基二甲基氯硅烷（ODS），从而在1973年推出了首个商业化单体键合C18色谱柱（7）。从那时起，传统的反相键合使用单官能硅烷来最大程度地提高配体覆盖率，避免不必要的聚合反应，这种聚合反应可能会影响批次间的可重复性。典型的单官能硅烷在最佳键合条件下会产生约3-4 µmol / m2的配体密度，基于典型二氧化硅表面上的平均8 µmol / m2的残留量，最多可保留硅烷醇原始量的50％。标记为“封端”，“最大覆盖率”或“高密度”的HPLC相仍然遵守该最大值，并且任何残留的硅烷醇仍将能够与分析物相互作用，从而有助于键合相的整体吸附性能。
多年来，传统键合相的缺点是与使用二氧化硅作为固体平台有关。在pH <2时，配体与二氧化硅表面的束缚会发生水解裂解，从而导致键合配体的损失，而在pH> 8时二氧化硅颗粒则易于溶解。但是，已开发出多种键合化学方法来克服这些缺点，并且许多商业上可用的阶段都可以缓解这些问题。
图1显示了几个C18相的创新键合结构。元素（a）显示了常规的单官能十八烷基硅烷和市场上最常见的相。元素（b）显示了当二氯硅烷或二烷氧基硅烷化学键合到二氧化硅上时形成的双官能硅烷；这种双重连接被认为可以提高配体在较低pH值下的稳定性并减少相渗出。一些制造商声称使用三官能硅烷（未显示），但是如何精确控制与二氧化硅表面的三齿反应仍存在争议，并且可能导致生产的再现性降低。元素（c）显示出一种“大体积”硅烷，其中异丙基或异丁基会在低pH值下阻碍硅氧烷键的水解裂解（8）。元素（d）显示“桥接”相，其中双齿有机硅烷接枝在二氧化硅颗粒上，更好地保护了表面免于在高pH下溶解。后一种桥接（交联）技术可以从一层保护层扩展到有机和无机保护层，从而为整个相提供高稳定性（9）。请勿将其与杂化二氧化硅颗粒混淆，后者的有机部分是颗粒结构的主要成分，而不仅仅是表面功能化（10）。
极性嵌入基团的其他主要类别是脲和氨基甲酸酯。它们是通过使异氰酸酯分别与伯胺和醇反应而获得的。与烷基相相比，这些官能团提供了额外的极性相互作用（作为氢键受体）和较少的离子相互作用，从而导致可极化化合物的选择性差异，同时改善了碱性分析物的峰形（18）。此外，由于丰富的羟基基团同时增强了它们的手性识别能力，氨基甲酸酯键已专门用于手性选择剂（如Pirkle型（19））和多糖的衍生化中。
硅烷化化学
尽管所有类型的分离模式的色谱柱化学多样性从未间断，但配体连接或接枝化学几乎没有变化。氯硅烷，烷氧基硅烷和硅氮烷一直是二氧化硅功能化的主力军。它们通过水解，缩合和聚合反应进行反应，在其中形成新的硅氧烷键（Si-O-Si）的同时产生小分子，通常是盐酸盐气体，二乙胺，甲醇，乙醇或水。有机硅烷与二氧化硅表面反应的结果不仅是有机材料与无机材料之间的桥联，而且还为每个固定相赋予了主要的分离方式。
材料科学中与硅相关的技术的进步推动了硅烷配体的合成。但是，最近对两家主要硅烷生产公司的收购导致当前硅烷组合的不确定性（21,22）。硅烷的合成虽然简单，但有一个警告：纯化。从混合物中纯化新合成的化合物时，选择快速柱色谱法。但是，所需的氯硅烷或烷氧基硅烷可能会永久结合在硅胶上，导致回收率差。尽管存在一些使硅胶钝化而不与硅烷配体（23）相互作用的方案，但大部分反应性有机硅烷提纯都依赖于简单蒸馏。这种方法导致将可商购的配体限制在特定的分子量范围内，并且包含足够热稳定以承受通过该技术纯化的官能团。
一种进化的键合技术使用氢硅烷，这是Pesek在HPLC固定相生产中通过氢化硅烷化化学的发展和应用而开发的（24）。 “ C型”二氧化硅在颗粒表面具有氢化硅（Si‑H），并且没有发现硅烷醇对A型和B型二氧化硅的负面影响。为了使该表面官能化，末端的炔烃或烯烃将在铂金属催化剂存在下与Si-H进行硅氢加成反应，从而形成具有改善的抵抗条件的相，该条件可能导致B型硅胶色谱柱发生水解。这部分是由于氢化硅部分所提供的疏水性表面要比普通的亲水性硅烷醇（25）大得多。
图3显示了氢化物封端的颗粒的烯烃和炔烃硅氢化反应的结果。炔烃可能会发生双重氢化硅烷化，从而导致二齿体附着在表面上，尽管由于空间位阻，大多数配体将通过硅碳双键（Si = C）单独附着（26）。氢化物的存在或硅烷醇的缺乏（<5％）以及氢化硅烷化产生的强Si-C或Si = C，使这些相具有了化学稳定性和色谱应用有趣的选择性。多年来使用了几种金属催化剂，但铂金仍然是金标准。六氯铂酸（H2PtCl6），也被称为Speier的催化剂，后来又将可溶于有机硅的Karstedt催化剂用于这种化学方法（27）。
对氢化硅烷化平台合成的研究导致一些未解决的问题和挑战。第一个挑战是关于键合反应后铂试剂的完全去除。催化剂可能形成胶体铂，该胶体可能沉积在颗粒内部深处，几乎无法去除。因此，无法达到使用B型二氧化硅作为第一个固体载体（28）的目的。第二个挑战是催化剂的选择性官能团耐受性，将弱的阴离子交换和许多混合模式相排除在氢化硅烷化平台之外（29）。第三个挑战，还有待争论的是，Si-H的覆盖率是否足够（〜95％），阻碍了色谱柱寿命期间尽可能多的表面硅烷醇和此类部分的惰性（30,31） 。最后一个挑战是相的可用性，以及其他制造商很难找到等效的色谱柱（32）。
新型固体支持物的功能化
分析柱的最常见格式为内径4.6毫米和2.1毫米。尽管毛细管柱尺寸较小，但在HPLC领域却占有一席之地，特别是对于复杂的生物应用。在过去几年中，毛细管（内径0.3-0.5毫米）和纳米规格（内径0.075-0.1毫米）变得越来越流行，许多厂商在这些尺寸的固定相中提供了不错的选择。与毫米级内径色谱柱类似，亚毫米内径色谱柱通过淤浆法填充有功能化二氧化硅颗粒。然而，这一过程显示出挑战性，并且对该领域进行了大量研究（33,34）。作为替代方案，近年来，包括整料和柱阵列在内的其他相载体也越来越受到关注，尽管它们两者都比颗粒填充床（35）承诺的背压更低或效率更高，但在此方面几乎没有提及这些格式的实用功能。
整体床通常是在成孔剂的存在下通过单体的自由基聚合原位形成的。尽管热聚合是可行的选择，但是在流体路径的狭窄空间中可能发生温度波动，从而改变沿塔（36）的床均匀性。单体本质上可以是有机的（苯乙烯或丙烯酸酯基的）或硅质的，并提供适量的合成手柄以允许表面官能化。然而，由于无机整料的性质在其制造过程中需要高温煅烧步骤，因此适当的官能化也必须在原位进行。 Hilder及其同事开发了一种内径为100×4.6 mm的ODS嫁接的流动方法。硅胶整体柱，其性能以商用C18整体柱和颗粒填充柱（37）为基准。从那时起，类似的类似流程的协议已应用于其他色谱柱尺寸。但是，仍然需要缓慢的试剂流速（mL / min）和高温来接枝常见的C18配体，从而导致单个分析型色谱柱的键合时间长达24小时（38）。有机基整体材料提供了多种合成功能化功能，这不在本文的讨论范围之内。但是，它们对有机溶剂的渗透行为以及对小分子的传质动力学受阻，导致色谱偏向于基于二氧化硅的整体色谱。有关更多信息，El Rassi及其同事最近发表了一篇评论，讨论了几种后聚合功能化策略（39）。
另一列格式涉及具有微流体通道的微制造设备。 Sepaniak及其同事描述了一种柱阵列结构的功能，该结构包括将柱的氧化硅层浸入纯十八烷基三氯硅烷（OTS）中，并将其加热到170°C持续2 h（40）。另一方面，De Malsche描述了一种流化方法，以对径向细长柱（REP）的二氧化硅多孔层进行功能化，其中在40 bar的压力下将ODS溶液注入过夜。尽管此方法成功接枝了C18相，但该过程仅允许在大约24小时的窗口内进行单个“列”功能化（41）。
由于新型格式显示出令人鼓舞的色谱优势，无论它们是开放式管状色谱柱，基于芯片的平台还是色谱柱隔室的整体小型化，接枝方案都必须脱离传统的硅烷化化学方法，以促进其大规模生产，同时确保低成本和高批量批间可重复性。目前，供应商能够在24小时内以千克规模生产功能化二氧化硅，可用于填充数百个甚至数千个常规分析或毛细管尺寸的色谱柱。鉴于金属和有机框架等新的固体支持物和平台，它们将不得不寻找有趣的方法来对其进行功能化。
参考消息：LCGC Europe-09-01-2020由于新型格式显示出令人鼓舞的色谱优势，无论它们是开放式管状色谱柱，基于芯片的平台还是色谱柱隔室的整体小型化，接枝方案都必须脱离传统的硅烷化化学方法，以促进其大规模生产，同时确保低成本和高批量批间可重复性。目前，供应商能够在24小时内以千克规模生产功能化二氧化硅，可用于填充数百个甚至数千个常规分析或毛细管尺寸的色谱柱。新型的固体支持物和平台（例如金属有机框架）将使科学家有义务找到有趣的方法来对其进行功能化，因为它们缺乏附着点，同时又扩大了其在分离科学中的适用性（42）。
结论
与气相色谱法（GC）相比，HPLC固定相不是必需的，因为科学家可以控制流动相的组成，这是分离选择性的有力工具（43）。但是，在文献和市场中，尤其是在混合模式领域，涌现出许多新颖的固定相，以满足更广泛的客户对解决方案的需求。已经设计出许多创新的化学方法来解决与二氧化硅相关的常见问题，这些问题是与二氧化硅（从大体积硅烷到极性嵌入物）的固体载体有关；但是，除了氢化硅烷化平台以外，实际的硅烷化技术在近半个世纪中一直保持不变。小型色谱系统已经在市场上，但是大部分表面改性工艺无法适应这些新格式，特别是根据客户需求的速度。流动功能化已显示出是常规颗粒键合方法的替代方法，但每次色谱柱制造的反应时间仍然过高。历史上，学术界和硅行业都开发了硅烷化技术。此外，这些新方法在文献中容易获得，并且需要无金属的条件，室温和更快的动力学。现在是色谱公司实施这种创新的接枝方案的时候了。
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