内标法的计算分三个阶段:
第一阶段:想要定量化合物A,但无法找到或者购买到化合物A的标准品,但可以购买到物理和化学性质与化合物A特别接近的化合物B,并且化合物B能够在色谱图上和化合物A完全分离(即分离度≥1.5),此时我们认为
根据上述公式,我们大概计算出化合物A的浓度
第二阶段:实际实践过程中,发现找到合适的内标化合物B比较困难,因此引入校正因子f,此时得到
根据上述公式,我们可以得到准确的化合物A的浓度,但是公式中的校正因子f,需要查找一些特殊的手册或者数据库得到。
第三阶段:内标标准曲线法阶段,即要定量化合物A,也可以购买到化合物A的标准品,此时还是要购买内标化合物B,具体做法如下:
将化合物A配置一系列浓度梯度,例如10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL,同时向这一系列梯度浓度的化合物A标准样品中添加相同量的化合物B,使得化合物B在化合物A的不同浓度溶液中的量是相等的,例如40 μg/mL,将上述一系列混合标准液分别注入到气相色谱或者液相色谱中分析,得到一些列谱图如下:
那么,此时我们会得到两组数据,一组为待测化合物A和内标化合物B的浓度比值,即浓度比(相对浓度);另外一组是待测化合物A和内表化合物的峰面积比值,即峰面积比(相对峰面积)。我们以浓度比为横坐标,峰面积比为纵坐标,拟合y=ax+b的线性方程,得到如下:
如果想要测量未知浓度的样品中化合物A的浓度,那么此时只需要向未知浓度样品中加入和标准曲线中等量的内标化合物B,便能通过拟合的线性方程计算得到化合物A的浓度。